mRNA工藝技術(shù)平臺(tái)之mRNA制劑

mRNA疫苗或藥物的生產(chǎn)工藝，主要分為質(zhì)粒DNA原液制備、mRNA原液制備、mRNA制劑制備三個(gè)階段。本文討論第三階段的工藝平臺(tái)，也是當(dāng)前挑戰(zhàn)最大的環(huán)節(jié)。

關(guān)鍵的制劑技術(shù)突破解決了mRNA的成藥性問題，使其從60年的科研之路走向臨床商業(yè)化應(yīng)用，并在此次疫苗應(yīng)用中大放異彩。據(jù)公開信息， BNT162b2和mRNA-1273 2021年累計(jì)銷售額超過580億美元。

mRNA制劑的主要工藝環(huán)節(jié)包括mRNA的包封/裝載、復(fù)合物純化、除菌過濾、無菌灌裝等，如下圖。整個(gè)制劑工藝的核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的選擇以及mRNA的包封/裝載，其余步驟采用的是現(xiàn)有成熟工藝。以當(dāng)前最主流的脂質(zhì)納米顆粒(LNP)載體為例，相關(guān)問題，就足夠頭疼。

▲ mRNA制劑生產(chǎn)工藝流程

1.mRNA原液復(fù)融

如果mRNA原液經(jīng)冷凍儲(chǔ)存或運(yùn)輸，那么其復(fù)融工藝是不容忽視的。具體原因和可用復(fù)融設(shè)備與質(zhì)粒DNA原液復(fù)融類似。需要注意的是，mRNA分子的穩(wěn)定性要遠(yuǎn)低于質(zhì)粒DNA，復(fù)融過程中需要注意避免重結(jié)晶。

2.mRNA包封/裝載

包封/裝載工藝的基礎(chǔ)是遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)開發(fā)。良好設(shè)計(jì)的遞送系統(tǒng)才能使mRNA分子進(jìn)入人體后避免被RNA酶降解、被有效遞送至靶點(diǎn)、穿過細(xì)胞膜并在胞內(nèi)釋放。目前主流是采用非病毒遞送系統(tǒng)，包括基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)（如核酸脂質(zhì)體復(fù)合物(lipolexes)、陽離子脂質(zhì)體）、基于聚合物的遞送系統(tǒng)（如polyplexes）、基于脂質(zhì)和聚合物的遞送系統(tǒng)（如lipopolyplexes）等。

以目前主流的LNP為例，其直徑約100 nm，由多種脂質(zhì)成分組成。Moderna公布的脂質(zhì)成分包括可電離陽離子磷脂：中性輔助磷脂：膽固醇：PEG修飾磷脂，摩爾比為50:10:38.5:1.5。如下圖，mRNA（紅色）與離子化的脂質(zhì)分子帶正電荷的末端結(jié)合形成復(fù)合物，脂質(zhì)的疏水端向外與輔助脂質(zhì)（藍(lán)色、綠色、黃色）疏水端結(jié)合，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。

▲ LNP的成分及mRNA包封結(jié)構(gòu)

mRNA-LNP包封制備的關(guān)鍵，除了脂質(zhì)成分配方外，就是工藝過程的控制了，即如何控制mRNA與脂質(zhì)成分的接觸和相互作用過程，以形成穩(wěn)定、均一、收率高的mRNA-LNP復(fù)合物。公開報(bào)道的LNP制備方法有超聲波、剪切、均質(zhì)（高壓&微射流）、擠出等。

以當(dāng)前主流的微流控混合技術(shù)來說，Pfizer/BioNTech采用的是沖擊式射流混合器，mRNA溶于偏酸性水相，脂質(zhì)體溶于乙醇，通過高壓使mRNA溶液與脂質(zhì)體溶液形成兩股射流對(duì)沖混合，強(qiáng)烈的湍流使各組分充分混合，同時(shí)乙醇相被稀釋，溶液pH變化，脂質(zhì)體析出形成脂質(zhì)納米顆粒并與mRNA形成包封復(fù)合物。

▲ KNAUER 沖擊式射流混合器

▲ KNAUER LNP包封設(shè)備

不同的廠家可能采用不同的微流控混合/擠出技術(shù)，尤其是微流道的設(shè)計(jì)，但通過兩相混合形成包封復(fù)合物這一原理是一致的。影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的因素除了兩相溶液自身成分特性、具體微流控混合/擠出技術(shù)外，還包括兩相溶液的注入溫度、壓力、流量、比率等。

▲ PreciGenome 兩相混合包封技術(shù)

▲ PNI NxGen混合包封技術(shù)

mRNA包封/裝載涉及的工藝設(shè)備及耗材主要是微流控設(shè)備和流路耗材，現(xiàn)有廠家有PNI/Danaher, PreciGenome, Dolomite Microfluidics, 邁安納, 艾特森等。原材料/試劑除mRNA原液外主要是各種脂質(zhì)體成分，最關(guān)鍵、用量也最大的的是陽離子脂質(zhì)。耗材試劑相關(guān)廠家有Polymun, PNI/Danaher, Evonik, 艾偉拓, 西寶生物, 漢方等。

3.超濾純化

mRNA包封后需要純化去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質(zhì)材料，并調(diào)整最終復(fù)合物濃度、置換溶劑緩沖體系、調(diào)節(jié)pH值等，此步驟通常通過超濾/切向流過濾實(shí)現(xiàn)，mRNA-LNP復(fù)合物被截留，雜質(zhì)及溶劑被洗濾。

超濾工藝為成熟技術(shù)，可選中空纖維或板式膜包，最關(guān)鍵的還是根據(jù)mRNA-LNP復(fù)合物的粒徑選擇合適的截留孔徑。根據(jù)最終制劑成品的配方要求，純化后的mRNA-LNP溶液可能還需要進(jìn)行制劑配液，添加必要的輔料成分，以利于產(chǎn)品的長期穩(wěn)定保存和體內(nèi)藥效發(fā)揮。超濾和配液相關(guān)的設(shè)備耗材品牌可見前兩篇。

4.除菌過濾

此步除菌過濾是最終產(chǎn)品無菌保障的關(guān)鍵，一般采用0.22μm除菌級(jí)過濾器冗余設(shè)置，截留細(xì)菌等微生物污染物。按照當(dāng)前的法規(guī)要求，必須要進(jìn)行使用后濾器完整性檢測(cè)以確保最終產(chǎn)品的無菌性。

除菌過濾為現(xiàn)有成熟技術(shù)，可用一次性囊式濾器或套筒式濾器，常見材質(zhì)有聚醚砜（PES）、聚偏二氟乙烯（PVDF）等。在選擇時(shí)重點(diǎn)關(guān)注材質(zhì)與產(chǎn)品的兼容性、溶出析出特性、通量及通量的衰減等。常用除菌過濾器品牌可見前兩篇。

5.無菌灌裝

對(duì)于無菌注射劑產(chǎn)品，灌裝技術(shù)需根據(jù)產(chǎn)品包裝容器來選擇。以mRNA疫苗所用西林瓶為例，無菌灌裝過程包括容器和膠塞的準(zhǔn)備、灌裝、加塞、軋蓋、燈檢等步驟。

、西林瓶的準(zhǔn)備步驟主要是洗瓶、干燥和除菌除熱原，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，行業(yè)常用洗烘灌聯(lián)動(dòng)線進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn)。膠塞的準(zhǔn)備過程主要是清洗和滅菌，可以在生產(chǎn)前采用清洗機(jī)和滅菌柜進(jìn)行準(zhǔn)備或直接采用免洗免滅菌的無熱原膠塞。

▲ 自動(dòng)化連續(xù)無菌灌裝加塞

由于灌裝過程為開放式操作，無菌污染的控制是最為關(guān)鍵的，要考慮到人員、設(shè)備、物料、環(huán)境和操作方法等方面，如無菌灌裝、加塞及產(chǎn)品未*密封時(shí)的轉(zhuǎn)移等操作均需要在環(huán)境進(jìn)行。

灌裝線常見的品牌包括Syntegon, B+S, IMA, Optima, Romaco/楚天, ROTA/奧星, 東富龍等。隨著一次性使用系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，灌裝機(jī)廠家開始與耗材廠家合作推出一次性灌裝系統(tǒng)，如Syntegon與Sartorius推出的PreVAS, 一次性使用耗材廠家也能提供灌裝耗材定制服務(wù)，如Pall, Merck, Avantor, Meissner, 樂純等。

6.包裝儲(chǔ)存運(yùn)輸

完成灌裝和質(zhì)檢的mRNA制劑產(chǎn)品，根據(jù)儲(chǔ)存運(yùn)輸要求被冷凍至儲(chǔ)存溫度，之后完成運(yùn)輸包裝以便于全球流通。對(duì)于需要冷凍儲(chǔ)存的mRNA產(chǎn)品，有必要在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程進(jìn)行持續(xù)的溫度監(jiān)測(cè)，以證明其始終處于規(guī)定的儲(chǔ)存溫度范圍，否則不能保證最終患者給藥時(shí)產(chǎn)品的安全性和有效性。

▲ mRNA疫苗成品進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存

雖然mRNA疫苗仍是當(dāng)前上市的mRNA產(chǎn)品，然而理論上通過mRNA可以編碼任何人類需要的蛋白，不論是作為疫苗還是治療性藥物。Moderna公開的在研管線就包括了預(yù)防性疫苗、全身性細(xì)胞內(nèi)治療、局部再生療法、全身性分泌和細(xì)胞表面治療、癌癥疫苗、腫瘤內(nèi)免疫腫瘤治療等。

據(jù) Nature 2021年9月份的綜述預(yù)測(cè)，mRNA疫苗在mRNA藥物市場(chǎng)的占比將隨著更多mRNA產(chǎn)品獲批上市而逐年下降，10年后將低于50%，更多mRNA產(chǎn)品將得以應(yīng)用。

▲ mRNA產(chǎn)品市場(chǎng)演變預(yù)測(cè)
我國《“十四五"醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃》明確提出加快核酸疫苗技術(shù)平臺(tái)建立，推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化，支持疫苗企業(yè)和重要原輔料、耗材、生產(chǎn)設(shè)備、包裝材料企業(yè)協(xié)作，提高各類產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)水平。可見mRNA技術(shù)平臺(tái)是一定要突破的。

整個(gè)mRNA制劑工藝流程中，核心挑戰(zhàn)在于遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和包封工藝，其余部分采用的是現(xiàn)有成熟技術(shù)。由于mRNA遞送技術(shù)當(dāng)前仍處于不斷摸索和更新中，未來仍有很多可變性和提升空間，目前仍很難將其稱作平臺(tái)工藝，相信隨著更多研究和應(yīng)用數(shù)據(jù)的積累，遞送技術(shù)平臺(tái)將逐步完善。另一方面，mRNA-LNP配方體系仍需要優(yōu)化以提升制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性，降低對(duì)冷凍儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)囊螅瑥亩?span style="font-family: Calibri;">mRNA產(chǎn)品的流通和臨床應(yīng)用。

此文對(duì)mRNA制劑工藝平臺(tái)進(jìn)行梳理的目的，在于讓同行更為了解整個(gè)工藝平臺(tái)及現(xiàn)有資源，以便于提升自身的工作效率；同時(shí)，讓更多同行了解國內(nèi)與國際品牌在工藝平臺(tái)能力上的差距，看到努力的方向。

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